脂肪干細(xì)胞在眼科的應(yīng)用及研究進(jìn)展

　　脂肪干細(xì)胞adipose-derived stem cells,ADSCs是存在于脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞,具有多向分化潛能,在特定的條件下可以分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞等中胚層細(xì)胞,甚至可以跨胚層分化為神經(jīng)細(xì)胞等外胚層細(xì)胞及肝細(xì)胞等內(nèi)胚層細(xì)胞。ADSCs還有易于獲取、對(duì)取材區(qū)損傷小等眾多優(yōu)勢,使其成為組織修復(fù)等領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。

　　本文對(duì)ADSCs的生物學(xué)特性及其在眼科領(lǐng)域的研究進(jìn)行了分類總結(jié),以期為ADSCs在眼科的應(yīng)用研究給予有益的提示。

　　脂肪干細(xì)胞adipose-derived stem cells,ADSCs是來源于脂肪組織,具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞。作為成體干細(xì)胞重要組成的ADSCs,因其不存在倫理學(xué)問題、易于獲取、體外增殖迅速及低免疫原性等眾多優(yōu)勢,引起大家廣泛關(guān)注。

　　在眼科領(lǐng)域,ADSCs相關(guān)的研究取得了長足進(jìn)展。我們就ADSCs的生物學(xué)特性及其在眼科領(lǐng)域的研究成果、研究中存在的問題及應(yīng)用前景做一歸納總結(jié),以期對(duì)今后的相關(guān)研究提供一些借鑒和思路。

　　1.ADSCs概述

　　1.1 ADSCs的來源

　　2001年,Zuk等首次于抽脂術(shù)后脂肪組織廢棄液中分離出的脂肪血管基質(zhì)成分中獲取了脂肪組織來源干細(xì)胞。其中,脂肪血管基質(zhì)成分是ADSCs、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及脂肪前體細(xì)胞等組成的細(xì)胞混合物。

　　ADSCs的獲取簡單、方便,可以從人脂肪抽吸術(shù)所得脂肪組織中大量獲得,約400～600mg脂肪組織即可獲得5×105個(gè)干細(xì)胞。

　　1.2 ADSCs的鑒定及多向分化潛能

　　研究發(fā)現(xiàn),ADSCs不僅與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在形態(tài)上比較相似,而且均表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD73,CD90和CD29,而不表達(dá)造血及內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物CD31,CD34,CD45和CD14。但是兩者之間也存在一定差異,如CD106在ADSCs中不表達(dá)而在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中陽性表達(dá);CD49d在ADSCs中表達(dá)而不在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)。

　　目前,大多數(shù)文獻(xiàn)仍以成脂、成骨等多向分化能力的鑒定作為ADSCs鑒定的主要方法。

　　近年來,隨著ADSCs誘導(dǎo)分化方面研究的深入,已經(jīng)證實(shí)ADSCs不僅能夠分化為中胚層細(xì)胞如脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞等,而且可跨胚層分化為外胚層細(xì)胞如神經(jīng)細(xì)胞等、內(nèi)胚層細(xì)胞如肝細(xì)胞等。

　　2.ADSCs在角膜上皮的應(yīng)用研究

　　角膜上皮來源于角膜緣干細(xì)胞的定向分化,具有較強(qiáng)的再生能力。但當(dāng)角膜嚴(yán)重?fù)p傷后引起大范圍角膜周圍纖維細(xì)胞浸潤、角膜翳及角膜瘢痕形成等,最終將導(dǎo)致角膜緣干細(xì)胞缺失limbal stem cell deficiency,LSCD。

　　角膜移植是LSCD較好的治療方法,但因?yàn)楣w不足、術(shù)后植片衰竭及免疫排斥反應(yīng)嚴(yán)重限制了這種治療。干細(xì)胞移植不失為一個(gè)替代方法。

　　ADSCs在角膜上皮的應(yīng)用可以分為兩類。一類是ADSCs對(duì)受損角膜上皮愈合的應(yīng)用研究;另一類是ADSCs向角膜上皮細(xì)胞分化的研究。

　　2.1 ADSCs

　　對(duì)受損角膜上皮愈合影響的應(yīng)用研究研究表明,ADSCs具有促進(jìn)角膜上皮愈合,降低免疫反應(yīng)的作用。Agorogiannis等報(bào)道了一例以自體ADSCs治療持續(xù)性角膜上皮缺損的患者?；颊咭蜷蠙鞓淙~造成角膜上皮創(chuàng)傷,形成潰瘍,遷延不愈。對(duì)患者進(jìn)行自體ADSCs移植,術(shù)后11d角膜上皮開始愈合,術(shù)后1mo,患者角膜上皮完全愈合。術(shù)后6mo隨訪,角膜上皮保持完整。

　　Zeppieri等以角膜堿化學(xué)傷的大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,局部進(jìn)行人ADSCs的移植。組織學(xué)結(jié)果顯示局部進(jìn)行ADSCs移植后,受損動(dòng)物角膜完全愈合,與對(duì)照組相比免疫細(xì)胞較少。說明ADSCs促進(jìn)受損角膜上皮愈合。

　　Lin等將ADSCs懸液采用兔結(jié)膜下注射的方法治療實(shí)驗(yàn)兔眼表堿化學(xué)傷,研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組角膜愈合的速度比對(duì)照組更快,組織學(xué)檢測顯示實(shí)驗(yàn)組形成了5～6層角膜上皮細(xì)胞層,而對(duì)照組為2～3層角膜上皮細(xì)胞層。

　　以上研究提示ADSCs移植于受損的角膜上皮,可以促進(jìn)角膜上皮的再生和修復(fù),加速角膜的愈合。然而,ADSCs在促進(jìn)受損角膜上皮愈合的同時(shí),是否其本身也有分化的傾向,以及最終的轉(zhuǎn)歸如何等問題值得進(jìn)一步探討。

　　2.2 ADSCs向角膜上皮細(xì)胞分化的研究

　　近年,ADSCs向角膜上皮細(xì)胞分化的潛能得到了證實(shí)。鐘劉學(xué)穎等在體外探究了不同的誘導(dǎo)體系對(duì)人ADSCs的分化作用。誘導(dǎo)體系中主要包括DMEM/F12體系、KM體系以及前兩者1:1的混合體系DMEM/F12/KM體系,并添加不同濃度的表皮生長因子epidermal growth factor,EGF。

　　結(jié)果顯示,不同濃度梯度細(xì)胞生長因子的KM體系誘導(dǎo)21d,廣譜角蛋白AE5陽性細(xì)胞約占90%以上,其中40g/L、50g/LEGF組AE5陽性表達(dá)率達(dá)到98%以上。

　　Martinez-Conesa等將ADSCs培養(yǎng)于細(xì)胞外基質(zhì)層,免疫熒光結(jié)果顯示細(xì)胞角膜上皮角蛋白CK3/76陽性表達(dá),PCR結(jié)果顯示細(xì)胞表達(dá)了祖細(xì)胞表面標(biāo)志物p63及ABCG2,角膜上皮標(biāo)志物CK12陽性表達(dá)。Western結(jié)果顯示誘導(dǎo)后ADSCsp63陰性、CK3/76和CK12弱陽性。

　　Ho等分別研究了眼眶脂肪組織來源和皮下脂肪組織來源的ADSCs誘導(dǎo)分化為角膜上皮樣細(xì)胞的能力。實(shí)驗(yàn)分為3組:第1組,角膜上皮細(xì)胞和ADSCs混合培養(yǎng);第2組,角膜上皮細(xì)胞來源的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)ADSCs;第3組,角膜上皮細(xì)胞和ADSCsTranswell共培養(yǎng)。

　　5d后熒光染色眶脂來源的ADSCs第1組混合培養(yǎng)的ADSCsCK3陽性表達(dá),第2組、第3組未觀察到陽性結(jié)果。皮下脂肪來源的ADSCs僅在第1組有少量表達(dá)。

　　Nieto-Miguel等研究了皮下脂肪組織誘導(dǎo)分化為角膜上皮樣細(xì)胞的能力。實(shí)驗(yàn)分為基礎(chǔ)培養(yǎng)液組basal culture medium,BM、角膜上皮細(xì)胞來源條件培養(yǎng)液BM conditioned with human corneal epithelial cells,HCEcBM、角膜緣成纖維細(xì)胞來源條件培養(yǎng)液組BM conditioned with limbal fibroblasts,LFcBM,各組分別培養(yǎng)于普通培養(yǎng)皿、Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)皿中。

　　誘導(dǎo)第15d,光鏡下觀察到HCEcBM組細(xì)胞發(fā)生了上皮樣改變。誘導(dǎo)第1,8,15,22d,RT-PCT結(jié)果顯示HCEcBM組細(xì)胞CK12明顯增高,這一結(jié)果被Westernblotting結(jié)果證實(shí)。

　　誘導(dǎo)后15d免疫熒光檢測顯示,HCEcBM組、LFcBM組細(xì)胞核周區(qū)域CK12陽性表達(dá)。另外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明普通培養(yǎng)皿、Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)皿對(duì)于誘導(dǎo)細(xì)胞分化方面沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　這些結(jié)果提示ADSCs可誘導(dǎo)為角膜上皮樣細(xì)胞,具有分化為角膜上皮細(xì)胞的潛能,但細(xì)胞在體條件下是否能保持角膜上皮細(xì)胞表型、細(xì)胞分化過程中細(xì)胞是否有其他表型等問題,需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

　　3.ADSCs在角膜基質(zhì)的應(yīng)用研究

　　角膜基質(zhì)層約占角膜厚度的9/10,由膠原纖維、角膜細(xì)胞等組成。其中,膠原纖維的有序排列是角膜透明的基礎(chǔ),也使角膜具有了一定的彈性和韌性。角膜基質(zhì)損傷后不能再生,通過瘢痕修復(fù)損傷部位,影響角膜的透明性。

　　ADSCs可以減低損傷部位的免疫反應(yīng),并且成功修復(fù)角膜基質(zhì),形成板層結(jié)構(gòu)。Arnalich-Montiel等將人ADSCs直接注入活體兔角膜內(nèi),術(shù)后12wk仍可檢測到人ADSCs的存在,沒有免疫排斥的現(xiàn)象發(fā)生,并且免疫學(xué)檢測顯示,細(xì)胞表達(dá)角膜基質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白聚糖keratocan,提示在體內(nèi)微環(huán)境誘導(dǎo)下人ADSCs向角膜基質(zhì)細(xì)胞方向分化。

　　鮑慧婧等將自體兔ADSCs與聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物polylactic-co-glycolic acid,PLGA支架復(fù)合后移植于兔角膜基質(zhì),成功重建受損的兔角膜基質(zhì)。

　　研究顯示兔ADSCs在PLGA支架上生長良好,材料12wk以后降解,角膜基本恢復(fù)透明。HE染色顯示新生角膜基質(zhì)與正常組織相似,電鏡下可見原缺損部位膠原纖維直徑與正常組織無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

　　Du等采用不同的誘導(dǎo)液在體外誘導(dǎo)人ADSCs向角膜基質(zhì)方向分化。實(shí)驗(yàn)因培養(yǎng)方法不同,分為纖維蛋白凝膠組和微球法培養(yǎng)組,角膜基質(zhì)誘導(dǎo)液培養(yǎng)3wk。免疫學(xué)檢測顯示keratocan及硫酸軟骨素在兩組不同方法培養(yǎng)的細(xì)胞的表達(dá),其中微球法培養(yǎng)組比纖維蛋白凝膠組表達(dá)廣泛。

　　Keratocan的表達(dá)通過RT-PCR方法得到證實(shí)。研究結(jié)果提示兩種方法均誘導(dǎo)人ADSCs分化為角膜基質(zhì)細(xì)胞樣的細(xì)胞。

　　Espandar等將人ADSCs接種于透明質(zhì)酸類支架,以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜熒光蛋白分子為標(biāo)記,移植于兔角膜基質(zhì)層。術(shù)后10wk檢測發(fā)現(xiàn),人ADSCs不僅在基質(zhì)層生長良好,而且表達(dá)了角膜基質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白keratocan、醛脫氫酶、玉型膠原等。

　　雖然上述研究表明ADSCs向角膜基質(zhì)樣細(xì)胞分化,提示了ADSCs的分化潛能。但是,ADSCs分化后,是否有部分細(xì)胞仍具有干細(xì)胞特性,是否可以不斷分化為角膜基質(zhì)細(xì)胞等問題需要進(jìn)一步的相關(guān)實(shí)驗(yàn)予以探究。

　　4．ADSCs在視網(wǎng)膜的應(yīng)用研究

　　視網(wǎng)膜由內(nèi)層的神經(jīng)上皮及外層的視網(wǎng)膜色素上皮構(gòu)成,具有感光并對(duì)光刺激進(jìn)行處理的重要功能。

　　許多視網(wǎng)膜疾病嚴(yán)重?fù)p害視力甚至致盲,如視網(wǎng)膜遺傳性、變形性病變,而目前的治療方法不能阻止其進(jìn)展。干細(xì)胞在視網(wǎng)膜疾病的相關(guān)研究為視網(wǎng)膜疾病治療提供了一個(gè)新的探索方向。

　　ADSCs在添加合適的誘導(dǎo)液后,可以分化為視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞、色素上皮細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。

　　許卓再等以不同的誘導(dǎo)方案嘗試將大鼠ADSCs誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)主要分為對(duì)照組、單獨(dú)誘導(dǎo)組、聯(lián)合誘導(dǎo)組。

　　主要誘導(dǎo)劑為EGF、激活素A、牛磺酸、視黃酸、視網(wǎng)膜細(xì)胞提取液等。各誘導(dǎo)組在誘導(dǎo)28d后細(xì)胞均在一定程度上表達(dá)了視紫紅質(zhì)、上皮細(xì)胞骨架蛋白CK及神經(jīng)嵴細(xì)胞來源S-100蛋白。

　　其中,單獨(dú)誘導(dǎo)組各組間誘導(dǎo)效應(yīng)相似,而聯(lián)合誘導(dǎo)組中包含EGF、?；撬?、視黃酸的誘導(dǎo)組效應(yīng)較好。提示ADSCs具有向光感受器及視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞分化的潛能。

　　2009年Vossmerbaeumer等采用人或豬的視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞來源條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)人ADSCs向視網(wǎng)膜色素上皮retinalpigmentepithelium,RPE方向分化。誘導(dǎo)液主要包括RPE來源的條件培養(yǎng)液、血管活性腸肽等,以不同的組合構(gòu)成相應(yīng)分組。

　　誘導(dǎo)5～8d后,結(jié)果顯示ADSCs表達(dá)了視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性蛋白BestroPHin,CK8,CK18及RPE65。促黑素細(xì)胞激素melanocyte-stimulating hormone,MSH誘導(dǎo)分化的ADSCs色素顆粒的形成。

　　晁煒靜等體外誘導(dǎo)人ADSCs向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化,免疫熒光顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)視紫紅質(zhì)和Pan-CK,提示細(xì)胞向光感受器細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分化。

　　2010年,Yang等采用糖尿病大鼠作為動(dòng)物模型,探討ADSCs移植對(duì)于糖尿病視網(wǎng)膜病變的改善。

　　ADSCs移植術(shù)后1wk,血糖水平顯著降低。伊文思藍(lán)染色基本沒有滲漏,提示血視網(wǎng)膜屏障的完整性提高。術(shù)后可以觀察到ADSCs存在于大鼠視網(wǎng)膜,并且表達(dá)了光感受器特異性蛋白視紫紅質(zhì)和星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白glial fibrillary acidic protein,GFAP。

　　韓國學(xué)者Yu等將人ADSCs移植于C57/BL6小鼠,以GFP作為示蹤蛋白探究ADSCs在發(fā)育階段鼠眼中的分化及轉(zhuǎn)歸。實(shí)驗(yàn)根據(jù)小鼠出生不同天數(shù)、移植后存活天數(shù)分組。

　　結(jié)果發(fā)現(xiàn),部分ADSCs表達(dá)了成熟神經(jīng)元的標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白質(zhì)microtubule-associated protein2,MAP-2、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP。出生后第5,10d,移植后7d被處死的小鼠比其他組分化的較好。然而,與其他干細(xì)胞如腦前體細(xì)胞相比,ADSCs向視網(wǎng)膜方向的分化非常有限。

　　ADSCs向視網(wǎng)膜神經(jīng)及色素上皮細(xì)胞的分化研究中,細(xì)胞雖然表達(dá)了光感受器細(xì)胞的標(biāo)志物,但是仍存在細(xì)胞是否具有正常光感受器細(xì)胞的功能以及分化細(xì)胞占ADSCs的比例等問題。

　　5．展望

　　ADSCs的發(fā)現(xiàn),極大地豐富了干細(xì)胞庫,并且在眼科領(lǐng)域的深入探索為Stevens-Johnson綜合征、嚴(yán)重的細(xì)菌感染及化學(xué)燒灼傷所致角膜緣干細(xì)胞缺失、視網(wǎng)膜遺傳性、變性性疾病等難治性眼病提供了一個(gè)可能的選擇。

　　目前,已經(jīng)有關(guān)于ADSCs向角膜上皮細(xì)胞、角膜基質(zhì)細(xì)胞及視網(wǎng)膜神經(jīng)、色素上皮細(xì)胞分化及應(yīng)用研究的報(bào)道。然而,這些研究仍存在許多問題:

　　1ADSCs的純化問題。

　　2絕大部分研究為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果,是否在人體也能得到相似的結(jié)果。

　　3ADSCs在眼科的應(yīng)用研究還停留在細(xì)胞表型的分化研究。對(duì)于ADSCs分化為某種成熟細(xì)胞表型后是否具備相應(yīng)的功能。

　　4分化過程中的哪些通路和因子起到關(guān)鍵作用。

　　5ADSCs在眼科領(lǐng)域的誘導(dǎo)分化尚未有成熟的誘導(dǎo)方案。

　　綜上所述,ADSCs在體外或體內(nèi)條件下具有促進(jìn)角膜損傷愈合、向角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素細(xì)胞分化的可能,有望成為眼科難治性疾病治療的新途徑。

來源：藥品資訊網(wǎng)信息中心

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