微生物制藥的一般工藝流程

工業(yè)微生物技術(shù)是可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要支撐，是解決資源危機(jī)、生態(tài)環(huán)境危機(jī)和改造傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的根本技術(shù)依托。工業(yè)微生物的發(fā)展使現(xiàn)代生物技術(shù)滲透到包括醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、能源、化工、環(huán)保等幾乎所有的工業(yè)領(lǐng)域，并扮演著重要角色。歐美日等國已不同程度地制定了今后幾十年內(nèi)用生物過程取代化學(xué)過程的戰(zhàn)略計(jì)劃，可以看出工業(yè)微生物技術(shù)在未來社會(huì)發(fā)展過程中重要地位。

微生物制藥技術(shù)是工業(yè)微生物技術(shù)的最主要組成部分。微生物藥物的利用是從人們熟知的抗生素開始的，抗生素一般定義為：是一種在低濃度下有選擇地抑制或影響其他生物機(jī)能的微生物產(chǎn)物及其衍生物。有人曾建議將動(dòng)植物來源的具有同樣生理活性的這類物質(zhì)如魚素、蒜素、黃連素等也歸于抗生素的范疇，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為傳統(tǒng)概念的抗生素仍應(yīng)只限于微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物。近年來，由于基礎(chǔ)生命科學(xué)的發(fā)展和各種新的生物技術(shù)的應(yīng)用，報(bào)道的微生物產(chǎn)生的除了抗感染、抗腫瘤以外的其他生物活性物質(zhì)日益增多，如特異性的酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、受體拮抗劑和抗氧化劑等，其活性已超出了抑制某些微生物生命活動(dòng)的范圍。但這些物質(zhì)均為微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，其在生物合成機(jī)制、篩選研究程序及生產(chǎn)工藝等方面和抗生素都有共同的特點(diǎn)，但把它們通稱為抗生素顯然是不恰當(dāng)?shù)?，于是不少學(xué)者就把微生物產(chǎn)生的這些具有生理活性（或稱藥理活性）的次級(jí)代謝產(chǎn)物統(tǒng)稱為微生物藥物。微生物藥物的生產(chǎn)技術(shù)就是微生物制藥技術(shù)。可以認(rèn)為包括五個(gè)方面的內(nèi)容：

第一方面菌種的獲得

根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。

分離思路新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來。實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進(jìn)行分離純化。具體分離操作從以下幾個(gè)方面展開。

定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。

采樣：有針對(duì)性地采集樣品。

增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)。

分離：利用分離技術(shù)得到純種。

發(fā)酵性能測(cè)定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測(cè)定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。

第二方面高產(chǎn)菌株的選育

工業(yè)上生產(chǎn)用菌株都是經(jīng)過選育過的。工業(yè)菌種的育種是運(yùn)用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對(duì)某個(gè)用于特定生物技術(shù)目的的菌株進(jìn)行的多方位的改造。通過改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強(qiáng)化，或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀。

工業(yè)菌種育種的方法：誘變、基因轉(zhuǎn)移、基因重組。

育種過程包括下列3個(gè)步驟：1在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。2希望基因型的選出。3改良菌種的評(píng)價(jià)包括實(shí)驗(yàn)規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模。

選擇育種方法時(shí)需綜合考慮的因素1待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系例如分批或者連續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)；2對(duì)這一特定菌種的遺傳和生物化學(xué)方面認(rèn)識(shí)的明了程度；3經(jīng)濟(jì)費(fèi)用。如果對(duì)特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半采用隨機(jī)誘變、篩選及選育等技術(shù)；如果對(duì)其遺傳及生物化學(xué)方面的性狀已有較深的認(rèn)識(shí)，則可選擇基因重組等手段進(jìn)行定向育種。

工業(yè)菌種具體改良思路：1解除或繞過代謝途徑中的限速步驟（通過增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應(yīng)基因的表達(dá)能力來提高限速酶的含量；在代謝途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個(gè)旁路代謝途徑。）2增加前體物的濃度。3改變代謝途徑，減少無用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對(duì)高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產(chǎn)品的耐受力。4抑制或消除產(chǎn)品分解酶。5改進(jìn)菌種外泌產(chǎn)品的能力。6消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制。如誘導(dǎo)代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類似物抗性。

第三部分菌種保藏技術(shù)

轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?

超低溫或在液氮中冷凍保藏；

土壤或陶瓷珠等載體干燥保藏。

第四部分發(fā)酵工藝條件的確定

微生物的營養(yǎng)來源

能源，自養(yǎng)菌：光；氫，硫胺；亞硝酸鹽，亞鐵鹽。異養(yǎng)菌：碳水化合物等有機(jī)物，石油天然氣和石油化工產(chǎn)品，如醋酸。

碳源，碳酸氣；淀粉水解糖，糖蜜、亞硫酸鹽紙漿廢液等，石油、正構(gòu)石蠟，天然氣，醋酸、甲醇、乙醇等石油化工產(chǎn)品

氮源，豆餅或蠶蛹水解液，味精廢液，玉米漿，酒糟水等有機(jī)氮，尿素，硫酸銨，氨水，硝酸鹽等無機(jī)氮，氣態(tài)氮

無機(jī)鹽，磷酸鹽，鉀鹽，鎂鹽，鈣鹽等其他礦鹽，鐵、錳、鈷等微量元素等

特殊生長因子，硫胺素、生物素、對(duì)氨基苯甲酸、肌醇等

培養(yǎng)基的確定

（1）首先必須做好調(diào)查研究工作，了解菌種的來源、生活習(xí)慣、生理生化特性和一般的營養(yǎng)要求。工業(yè)生產(chǎn)主要應(yīng)用細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌四大類微生物。它們對(duì)營養(yǎng)的要求既有共性，也有各自的特性，應(yīng)根據(jù)不同類型微生物的生理特性考慮培養(yǎng)基的組成。

（2）其次，對(duì)生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)條件，生物合成的代謝途徑，代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、一般提取方法和產(chǎn)品質(zhì)量要求等也需要有所了解，以便在選擇培養(yǎng)基時(shí)做到心中有數(shù)。

（3）最好先選擇一種較好的化學(xué)合成培養(yǎng)基做基礎(chǔ)，開始時(shí)先做一些搖瓶實(shí)驗(yàn);然后進(jìn)一步做小型發(fā)酵罐培養(yǎng)，摸索菌種對(duì)各種主要碳源和氮源的利用情況和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的能力。注意培養(yǎng)過程中的pH變化，觀察適合于菌種生長繁殖和適合于代謝產(chǎn)物形成的兩種不同pH，不斷調(diào)整配比來適應(yīng)上述各種情況。

（4）注意每次只限一個(gè)變動(dòng)條件。有了初步結(jié)果以后，先確定一個(gè)培養(yǎng)基配比。

其次再確定各種重要的金屬和非金屬離子對(duì)發(fā)酵的影響，即對(duì)各種無機(jī)元素的營養(yǎng)要求，試驗(yàn)其最高、最低和最適用量。在合成培養(yǎng)基上得出一定結(jié)果后，再做復(fù)合培養(yǎng)基試驗(yàn)。最后試驗(yàn)各種發(fā)酵條件和培養(yǎng)基的關(guān)系。培養(yǎng)基內(nèi)pH可由添加碳酸鈣來調(diào)節(jié)，其他如硝酸鈉、硫酸銨也可用來調(diào)節(jié)。

（5）有些發(fā)酵產(chǎn)物，如抗生素等，除了配制培養(yǎng)基以外，還要通過中間補(bǔ)料法，一面對(duì)碳及氮的代謝予以適當(dāng)?shù)目刂疲幻骈g歇添加各種養(yǎng)料和前體類物質(zhì)，引導(dǎo)發(fā)酵走向合成產(chǎn)物的途徑。

6根據(jù)經(jīng)濟(jì)效益選擇培并基原料

考慮經(jīng)濟(jì)節(jié)約，盡量少用或不用主糧，努力節(jié)約用糧，或以其他原料代糧。糖類是主要的碳源。碳源的代用品主要是尋找植物淀粉、纖維水解物，以廢糖蜜代替淀粉、糊精和葡萄糖，以工業(yè)葡萄糖代替食用葡萄糖；石油作為碳源的微生物發(fā)酵也可以生產(chǎn)以糧食為碳源的發(fā)酵產(chǎn)品。有機(jī)氮源的節(jié)約和代替主要為減少或代替黃豆餅粉、花生餅粉、食用蛋白胨和酵母粉等含有豐富蛋白質(zhì)的原料為目標(biāo)，代用的原料可以是棉籽餅粉、玉米漿、蠶蛹粉、雜魚粉、黃漿水或麩汁、飼料酵母、石油酵母、骨膠、菌體、酒糟，以及各種食品工業(yè)下腳料等。這些代用品大多蛋白質(zhì)含量豐富，價(jià)格低廉，便于就地取材，方便運(yùn)輸。

培養(yǎng)工藝的確定：

培養(yǎng)條件：溫度、pH值、氧、種齡、接種量、溫度

工業(yè)微生物的培養(yǎng)法分為靜置培養(yǎng)和通氣培養(yǎng)兩大類型。

靜置培養(yǎng)法即將培養(yǎng)基盛于發(fā)酵容器中，在接種后，不通空氣進(jìn)行發(fā)酵，又稱為厭氧性發(fā)酵。通氣培養(yǎng)法的生產(chǎn)菌種以需氧菌和兼性需氧菌居多，它們生長的環(huán)境必須供給空氣，以維持一定的溶解氧水平，使菌體迅速生長和發(fā)酵，又稱為好氣性發(fā)酵。

在靜置和通氣培養(yǎng)兩類方法中又可分為液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩大類型，其中每一類型又有表面培養(yǎng)與深層培養(yǎng)之分。

關(guān)于液體深層培養(yǎng)：

用液體深層發(fā)酵罐從罐底部通氣，送入的空氣由攪拌槳葉分散成微小氣泡以促進(jìn)氧的溶解。這種由罐底部通氣攪拌的培養(yǎng)方法，相對(duì)于由氣液界面靠自然擴(kuò)散使氧溶解的表面培養(yǎng)法來講，稱為深層培養(yǎng)法。特點(diǎn)是容易按照生產(chǎn)菌種對(duì)于代謝的營養(yǎng)要求以及不同生理時(shí)期的通氣、攪拌、溫度、與培養(yǎng)基中氫離子濃度等條件，選擇最佳培養(yǎng)條件。

深層培養(yǎng)基本操作的3個(gè)控制點(diǎn)

①滅菌：發(fā)酵工業(yè)要求純培養(yǎng)，因此在發(fā)酵開始前必須對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行加熱滅菌。所以發(fā)酵罐具有蒸汽夾套，以便將培養(yǎng)基和發(fā)酵罐進(jìn)行加熱滅菌，或者將培養(yǎng)基由連續(xù)加熱滅菌器滅菌，并連續(xù)地輸送于發(fā)酵罐內(nèi)。②溫度控制：培養(yǎng)基滅菌后，冷卻至培養(yǎng)溫度進(jìn)行發(fā)酵，由于隨著微生物的增殖和發(fā)酵會(huì)發(fā)熱、攪拌產(chǎn)熱等，所以為維持溫度恒定，須在夾套中以冷卻水循環(huán)流過。③通氣、攪拌：空氣進(jìn)入發(fā)酵罐前先經(jīng)空氣過濾器除去雜菌，制成無菌空氣，而后由罐底部進(jìn)人，再通過攪拌將空氣分散成微小氣泡。為了延長氣泡滯留時(shí)間，可在罐內(nèi)裝擋板產(chǎn)生渦流。攪拌的目的除了溶解氧之外，可使培養(yǎng)液中微生物均勻地分散在發(fā)酵罐內(nèi)，促進(jìn)熱傳遞，以及為調(diào)節(jié)pH而使加入的酸和堿均勻分散等。

第五部分發(fā)酵產(chǎn)物的分離提取

提取方法：

過濾

離心與沉降

細(xì)胞破碎

萃取

吸附與離子交換

色譜分離

沉析（鹽析、有機(jī)溶劑沉析、等電點(diǎn)等）

膜分離

結(jié)晶

干燥

分離提取過程的幾個(gè)注意的問題：

水質(zhì)

熱源去除（石棉板吸濾、活性碳吸附、過離子交換柱）

溶劑回收

廢物處理

生物安全性

來源：生物前沿科學(xué)

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